Генетики з Університету Лейпцига створили молекулярний пристрій, який показав в реальному часі процес розкручування подвійної спіралі ДНК. Це дозволило вченим пояснити, чому при процесі редагування ДНК за допомогою технології CRISPR-Cas трапляються помилки. Виявилося, що при досягнутому сьогодні рівні точності ці помилки неминучі.
Генетики побачили, як розкручується ДНК і зрозуміли, що в процесі занадто великі теплові коливання. Це показало, чому “молекулярні ножиці” не працюють як слід: вони коливаються. А значить поки CRISPR-технології редагування ДНК застосовувати для внесення змін в геном ембріона людини не можна.
Коли бактерії піддаються атаці вірусу, вони можуть захистити себе за допомогою механізму, який захищає їх від генетичного матеріалу порушником. Ключем до нього є білкові комплекси CRISPR-Cas. Тільки в останнє десятиліття була відкрита і з’ясована їх функція в адаптивному імунітеті мікроорганізмів.
За допомогою вбудованої РНК комплекси CRISPR розпізнають коротку послідовність у ДНК порушника. Механізм розпізнавання послідовності РНК сьогодні використовується для вибіркового вимкнення та модифікації генів у будь-яких організмах. Це відкриття зробило революцію в генній інженерії і вже в 2020 році було відзначено Нобелівською премією з хімії, присудженої Еммануель Шарпентьє і Дженніфер А. Дудна.
Однак іноді CRISPR-комплекси реагують і на сегменти генів, які незначно відрізняються від послідовності, заданої РНК. Це призводить до небажаних побічних ефектів в медичних додатках: «молекулярні ножиці» (білок Cas9) в такому випадку можуть помилитися і відрізати не той фрагмент, який потрібен. Ризик настільки великий, що використання CRISPR-технології сьогодні обмежене, фактично генною інженерією рослин. “Причини цього поки не цілком зрозумілі, оскільки дотепер цей процес не вдавалося спостерігати безпосередньо», — говорить Домінік Кауерт, співавтор роботи.
Як побачити кожен нуклеотид
Щоб краще зрозуміти процес розпізнавання і нарешті з’ясувати чому РНК (так звана провідна РНК) помиляється, команда під керівництвом професора Ральфа Зайделя та Домініка Кауерта з Університету Лейпцига скористалася тим фактом, що подвійна спіраль ДНК, яку потрібно відредагувати, розкручується під час розпізнавання, щоб забезпечити сполучення основ з РНК. Після цього подвійна спіраль являє собою два паралельних одинарних ділянки. А сам процес розкручування має певну механічну силу і може впливати на інші мікрооб’єкти.
“Головне питання проекту полягало в тому, чи можна взагалі побачити розкручування ділянки ДНК довжиною всього 10 нанометрів в реальному часі», — говорить Кауерт.
Для детального спостереження за процесом розкручування вчені повинні були зробити його видимим для мікроскопа. Для досягнення цієї мети команда використовувала досягнення нанотехнологій ДНК, за допомогою яких можна створити будь-яку тривимірну наноструктуру ДНК.
Використовуючи так звану техніку ДНК-орігамі, дослідники сконструювали роторний рукав ДНК довжиною 75 нм, до кінця якого була прикріплена золота наночастинка. В експерименті сила обертання послідовності ДНК товщиною 2 нм і довжиною 10 нм передавалася золотій наночастинці діаметром 160 нм. Наночастинка золота починала обертатися, а цей рух вже можна було відстежити за допомогою мікроскопа.
Схема роботи та мікрофотографії пристрою візуалізації CRISPR технології Nature Structural & Molecular Biology (2023). DOI: 10.1038 / s41594-023-01019-2 Схема роботи нанодвигуна і фотографії трансмісійного електронного мікроскопа (тем). a. тривимірна схема наномотора, що включає поворотний важіль орігамі та aunp (наночастинка золота) розміром 50 нм. Сині циліндри являють собою окремі спіралі одинарної ДНК (ssDNA). Вставки зверху та знизу показують збільшені кути нахилу, а також схематичні зображення інтерфейсів лігування ssDNA на кожному кінці стрижня, де два комплементарні звиси дужок ssDNA сусідніх спіралей (помаранчеві) та вторинний інтерфейсний оліго утворюють липкий кінець для лігування. Інші кінці спіралей несуть шестинуклеотидні скріпки ssDNA (фіолетові), що запобігають злипання плечей ротора. Вставки в центрі показують детальні та схематичні зображення прикріплення AuNP до кінця роторного плеча, в якому з’єднуються нитки ДНК гібридизуються в конфігурації, що нагадує блискавку. b. Оглядове зображення декількох роторних плечей ДНК-орігамі в тем і зображення окремих структур (вгорі). c, огляд tem-зображення ротора ДНК-орігамі з прикріпленими 50 нм AuNP та зображення окремих структур (зверху). Наноротор зв’язується з виступами на AuNP. Всі тем-зображення масштабовані з однаковим збільшенням. Довжина масштабних смуг становить 100 нм, при цьому довжина кожного чорно-білого сегмента дорівнює 20 нм. Тем-зображення виконані на 3 незалежних препаратах.
За допомогою цього методу дослідники спостерігали розпізнавання фрагмента цільової ДНК комплексом CRISPR практично пара за парою основ. Виявилося, що сполучення основ цільової ДНК з гідової РНК нестабільно. І весь комплекс CRISPR нестабільно пов’язаний з цільовою ДНК під час розпізнавання послідовності. Наче провідна РНК “бачить” цільовий фрагмент нечітко.
Після розпізнавання всієї послідовності відбувається стабільне зв’язування і подальше «перекушування» ДНК «молекулярними ножицями». Якщо РНК не може розпізнати фрагмент, то процес переривається. Це невелика біда, гірше якщо РНК приклеїться компліментарним зв’язком не до того фрагменту, який потрібен. А ось це вже може привести до справжньої катастрофи, особливо якщо мова йде про редагування ембріональної ДНК.
Відкриття допоможе правильно підбирати РНК
Те, що процес розпізнавання іноді дає невірні результати, пояснюється його стохастичною природою, тобто випадковими рухами молекул, що і вдалося продемонструвати дослідникам. “Розпізнавання послідовностей відбувається під дією теплових коливань при сполученні основ”, – говорить Кауерт.
За допомогою отриманих даних вдалося створити термодинамічну модель розпізнавання послідовностей, яка описує розпізнавання коливальних сегментів гідової РНК і цільової ДНК. В майбутньому це дозволить краще підбирати послідовності РНК, які розпізнають тільки потрібну послідовність-мішень, оптимізуючи тим самим точність генетичних маніпуляцій.
Оскільки розроблені наноротори універсальні за своєю придатністю для вимірювання крутних моментів в одиночних молекулах, вони можуть бути використані і для інших комплексів CRISPR-Cas або біомолекул.
Результат говорить про те, що сьогоднішні обмеження на використання CRISPR абсолютно виправдані. Тому що виходить, що “молекулярні ножиці” працюють не “так як треба”, а “приблизно так як треба”. І значить редагувати, наприклад, ДНК ембріона людини таким інструментом занадто ризиковано.
